1、分离方法适用于哪些种类样品中的外泌体提取?

可用于细胞上清液、血清、血浆、尿液及其他低密度体液(如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等)的外泌体提取。

2、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存?

可以。血样、尿样、体液等，需要攒齐了一起提取，或者同一个患者的样本多次提取。冻存前，首先要离心去除细胞和血小板，再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。长期请保存于-80℃，无须加冻存液;短期(1-2天内)则保存于4℃即可。

3、外泌体提取后是否可以冻存?

可以。使用硅化E.P.管或冻存管，减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融，建议分装，避免多次反复冻融。对于一些功能性实验，建议不要冻存，直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。

4、需要从血浆中分离外泌体，可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗?

不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂，用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。采血管的选择：血浆(plasma)：紫盖采血管;血清(serum)：黄盖采血管(促凝管或促凝管带分离胶)。

5、粘度过大的样品如何处理?

如果样品粘度过大时(因细胞分泌物较多所致)，可将样品用1×PBS缓冲液进行等体积稀释。

6、培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体?

多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下两种方法：

(1)将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h以去除血清外泌体;

(2)选择无血清培养基进行细胞培养。

7、无外泌体血清培养基(或者无血清培养基)在什么时候使用?

细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基(或者无血清培养基)，继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

8、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取?

会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占比不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体。

9、如何鉴定提取的外泌体?

通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行Western blot检测时，通常检测外泌体标志蛋白(CD63、CD9、CD81、TSG101等)。

10、准备做细胞外泌体Small RNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少?

普通肿瘤细胞系推荐使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞(如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等)中外泌体含量比较低，建议先通过10kD超滤柱浓缩，准备40mL以上的浓缩液再进行超速离心分离外泌体。

11、进行外泌体RNA RT-PCR实验推荐什么内参?

取决于具体样品，可以选择外源添加cel-miR-39-3p，或内源U6、SNORD61、SNORD68、SNORD72作为内参。

12、提取的外泌体进行Western blot前是否需要加入RIPA试剂裂解?

需要，一般按照1:1的比例加入RIPA试剂。

13、进行外泌体Western blot鉴定时有无内参蛋白可供选择?

无，该检测属于定性检测。

14、组织细胞外泌体如何提取?

无菌环境下将组织剪成小块(越小越好)，然后在无血清的培养基中培养12h;将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中;先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再进行超速离心分离外泌体。